疏水色谱柱采用具有适度疏水性的填料作为固定相，以含盐的水溶液作为流动相。在高浓度盐溶液中亲水性较强的物质分子内部的疏水基团外露，这些疏水基团可以与疏水的固定相以疏水作用力相结合(吸附)。由于不同物质与固定相之间的疏水作用力大小不同，可以通过改变极性流动相的离子强度(由高到低)来使这些物质依次解吸附，从而实现分离。具体来说，高浓度的盐液先将吸附力弱(极性大)的物质洗脱下来，而低浓度的盐则使吸附力强(极性小)的物质后洗脱下来。对于极性非常强的物质，可能需要在流动相中添加有机溶剂以降低其极性，从而使其解吸附，但此时需注意防止有效成分变性。
疏水色谱柱的结构包括填料、填充率、碳数、孔径大小、填充剂密度等关键要素。其中，填料的疏水性质主要由碳链、芳香族、烷基等疏水基团构成。填充率越高，疏水作用越强；碳数越多，水作用也越强；孔径大小则直接影响分离效果，孔径越小，分离效果通常越好；而填充剂密度则关系到柱效的高低，密度越大，柱效越高。
优点:
分离效果好:能够高效分离不同性质的物质。
选择性强:通过调整流动相条件可以精确控制分离过程。
适用范围广:可用于多种类型样品的分离。
操作简便:自动化程度高，易于操作。
柱效稳定:在正确使用和维护下，杜效能够保持稳定，
局限性：
对于水溶性样品适用性较差。
疏水基团易受污染，可能影响分离效果。
可能存在柱寿命较短的问题，特别是当处理高浓度或腐蚀性样品时。
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