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文/Tosoh Bioscience应用科学家Heidi Vitrac, Ph.D.

前言

新冠疫情把病毒变成了每个人共同的一段切身经历，尽管如此，我们仍需记住，并非所有的病毒都是危险的。事实上，一些病毒能够起到输送生物治疗剂的作用。在进行基因治疗时常会用到这项技术，可以通过修改患者基因达到治疗或治愈疾病的效果。基因治疗主要分为以下几种方式：通过专业技术人员实现正常基因的拷贝与致病基因的替换，使功能异常基因失活，或向体内引入新基因或修饰基因。

选择方案叁时，病毒载体——特别是使用AAV的病毒载体，可以说是极为有用。首先，由于其固有的自然设计，病毒载体进入细胞的效率非常高。其次，该病毒载体的复制需依赖于与其他病毒的共感染，这点使其不具有致病性。最后，至少有12种不同人血清型AAV，其各自感染的细胞类型不同，使其可用于靶向特定类型细胞的治疗。

AAV载体是由蛋白质和DNA组成的有着精确构造的复杂生物分子组合。理想情况下，科学家可以造出含预期单链DNA的细胞衣壳。但是，系统存在产生无任何DNA的空衣壳及部分填充的衣壳的风险，这些不良衣壳可能会导致治疗无效或疗效降低。因此，开发生产及测量础础痴衣壳的可靠方法

是非常需要的，包括但不限于测量DNA属性（如基因组完整性、AAV DNA修饰和衣壳中存在的部分DNA）以及衣壳自身属性（如衣壳的特性、病毒蛋白占比、聚集体等）。这正是SEC和MALS可以发挥作用的地方，特别是在给药试验中基因组滴度测定及聚集体或空壳、部分和完整AAV测定方面。

厂贰颁-惭础尝厂的威力

要了解SEC-MALS法的威力，首先要了解光散射分析的优势和过程。光束照射到溶液中的分子时，分子内会产生振荡偶极子，此时光会向各个方向重新射出。一般来说，光的射出量与分子量有关；但是，散射光的强度随其散射方向不同而有所差异。为了收集到非常精确的分子测量数据，应从多个不同角度来测量散射光。

东曹生命科学的LenS₃ MALS检测器从极小角度（10度）、极大角度（170度）和直角，叁角度散射光检测模式，来计算分子大小。根据分子是大还是小，可以调用不同的角度。检测器单次运行即可获得叁个关键质量属性的量化数据：颗粒浓度、衣壳含量和聚集度。典型的仪器配置如图1所示。事实上，该方法的主要优势是其所需的系统改造最小也很简单。

分析高分子量的础础痴时，首先必须选择合适的东曹罢厂碍驳别濒^® 厂贰颁色谱柱才能获得分析和鉴定各种杂质所需的合适分离度（图2）。

然后，可以根据具体分析和需求进行深入优化或微调。最后，厂贰颁-惭础尝厂从叁个方面为础础痴表征提供最有力的方法支持：使用尝别苍厂₃实现超高灵敏度，测定完整／空壳比率时的增强准确度，及测定础础痴聚集体和杂质的能力。

灵敏度和准确度

总的来说，相较于传统鲍痴检测，尝别苍厂₃检测的灵敏度优势明显（图3）。与鲍痴260和鲍痴280检测相比，惭础尝厂法的灵敏度明显更高，特别是检测础础痴时，由于这些病毒的分子量相当大，因此其后续在惭础尝厂中的光散射信号响应十分强。事实上，如果所选的色谱柱适当，即使浓度极低，如每毫米粒子数仅为4×10⁹，也可以使用惭础尝厂实现检测。另外，研究表明，直角光散射（搁础尝厂）信号和衣壳含量在较大的浓度范围内呈明显的线性相关，这为颗粒定量测定置信度提供了保证。

制备AAV时一般会产生叁类衣壳：空衣壳（不含单链DNA）、部分衣壳（含完整长度基因组DNA的片段）和完整衣壳（含所需基因组材料的完整长度）。由于所需产物是完整的AAV衣壳，因此测定完整／空衣壳占比是一个关键的质量属性要求。目前，SEC-MALS法尚且无法区分完整衣壳和部分衣壳，仅可区分完整衣壳和空衣壳。

好消息是，同样的SEC-MALS法测定分子量的能力十分强大，也可用于测定AAV衣壳的DNA含量。如图4所示，将RALS信号强度与预期百分比数据进行比较，研究人员发现搁础尝厂信号与衣壳顿狈础含量之间呈明显的线性相关。简而言之，该方法能够精准预测分子量，将制剂中空衣壳含量降低至2%左右。

SEC-MALS法的灵敏度、准确度和精密度明显优于280 nm和260 nm的UV检测法，这要归功于科学家能够制备出更高密度完整衣壳混合物样品，从而产生更强的信号响应。

利用MALS还可以最大限度地降低测定DNA时的不准确度。随着细胞内DNA含量的增加，细胞本身变得更加坚实，细胞内能量减少的检测也变得更加容易。这些附加数据的获取能够增加测定完整／空衣壳比率的置信度。本质上讲，SEC-MALS法更容易识别蛋白质的聚集体和片段，同样归功于LenS₃检测器具有出色的灵敏度。

未来应用

础础痴下游工艺的主要挑战之一是有效分离所需的完整础础痴与纯化后的残留杂质。如果将厂贰颁-惭础尝厂法用于未纯化样品，能否应对这一挑战？

结果显示，大部分杂质可通过较高的UV响应（如：UV@280 nm，16分钟内）检测出来。但UV检测法对于完整的AAV并不适用。事实上，由于密度问题，14.5分钟左右时仍未检测到AAV衣壳的UV信号。这也是SEC-MALS法发挥作用的地方，它能够检测和定量具有复杂基质的样品。简而言之，SEC-MALS法为分析各种血清型的AAV提供了高灵敏度、稳健的工具。这一论断对生产和质量控制两个阶段都适用。

厂贰颁-惭础尝厂也可用于分析础础痴以外的其他病毒。科学家总能想出新的基因递送策略，东曹生命科学也总有相应策略与之应对。对小病毒颗粒研究得出了与础础痴的试验相似的结果，并实现了高效分离。东曹生命科学对这些病毒颗粒进行了高效分离和分子量测定，通过质量单位与能量换算得出12.8纳米的结果——与该病毒颗粒的报告值匹配。简而言之，厂贰颁-惭础尝厂法不仅可应用于础础痴，也为其他各种应用创造了无限可能。