反相色谱是迄今在高效液相色谱中应用*广泛的技术，主要是因为它适用于分析极大多数的非极性物质和很多的可离子化的及离子化合物。大多数用于反相色谱的固定相本质上都是疏水物质，因此，分析物是按照它们与固定相的疏水相互作用的大小程度来分离的，样品基体中其它疏水杂质组分也能以同样的方式保留。
反相色谱柱是一种常用的色谱柱产物，主要由储液器、泵、进样器、色谱柱、检测器、记录仪等几部分组成，被广泛用于多个领域中。在反相色谱柱的使用中，保持色谱柱的柱效、容量和渗透特性，延长柱子的使用寿命非常重要。使用时间后就会出现柱压升高、柱效降低、峰形畸变和分离度降低、保留时间改变等变化，如不采取措施，将会缩短色谱柱的使用寿命，影响工作效率，并造成一定的经济损失。
有哪些因素会影响到反相色谱柱呢？
(1)柱长
有机小分子和肽类的分辨率随柱长的增加而增加．但是柱长增加并不能使蛋白质和核酸等生物大分子的分辨率显着增加．它们在较短的柱子上往往也有很好的分离效果。
(2)流动相的流速。
有机小分子和肽类的分辨率对流动相流速非常敏感。而蛋白质和核酸等生物大分子的分辨率则不然。流速越小，柱子越长，色谱峰的宽度就越大，分辨率就越小。制备色谱上样过程中的流速对动态吸附容量影响很大。
(3)温度。
温度上升，流动相黏度下降，流动速度加快，且流动相与固定相之间的传质速度加快，使分辨率增加。同时，温度上升，分子热运动增加，疏水性作用减弱。升高温度要考虑目标物质的热稳定性。
(4)流动相组成。
流动相的极性越大，溶质的分配系数越大，洗脱时间越短。搁笔颁多采用降低流动相极性(水含量)的线性梯度洗脱法。水是极性锄耻颈强的溶剂，在反相色谱中常常和基础溶剂配合使用，向流动相中加入不同浓度的、可以与水混溶的有机溶剂，以得到不同强度的流动相，这些有机溶剂称为修饰剂。反相色谱中锄耻颈常用的有机溶剂有甲醇和乙腈。此外，乙醇、四氢呋喃、异丙醇及二氧六环也常被用作修饰剂。有机溶剂梯度的大小也会影响分辨率，一般梯度越小．分辨率越大。
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