反相色谱法以被测的高分子为固定相、以惰性气体为流动相，为了测定需要，在流动相中加入一些探针分子，它们是挥发性的低分子。将探针分子注入气化室气化后，由载气带入色谱柱，测定它们在两相中的分配，从而研究高分产的各种性质，高分子与探针分子的相互作用以及高分子与高分子间的相互作用。
反相色谱是迄今在液相色谱中应用广泛的技术，主要是因为它适用于分析极大多数的非极性物质和很多的可离子化的及离子化合物。大多数用于反相色谱的固定相本质上都是疏水物质，因此，分析物是按照它们与固定相的疏水相互作用的大小程度来分离的，样品基体中其它疏水杂质组分也能以同样的方式保留。
在反相色谱法中的固定相是被共价结合到硅胶载体上的直往饱和烷烃，其链的长短不同，长的是十八烷基、这也是使用得多的固定相、流动相的极性比固定相的极性强。在反相键合相色谱中，极性大的组分先流出、性小的组分后流出。一般说来，固定相上的烷基配合基或被分离分子中非极性部分的表面积越大，或者流动相表面张力及介电常数越大，则缔合作用越强，保留值越大。
反相色谱的影响因素：
1、溶质的分子结构（极性）
极性越弱，疏水性越强，办越大，迟搁也越大。同系物碳数越多，极性越弱，办越大；引入极性取代基，降低疏水性，办值变小。
2、固定相
键合烷基的疏水性随碳链的延长而增加，溶质的办也增大。硅胶表面键合烷基的浓度越大，则溶质的办越大。
3、流动相
极性越强，洗脱能力越弱，使溶质的办越大；溶剂种类：水为弱溶剂，醇为强溶剂；溶剂比例：水的比例增加，使办增大。
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